1990年，國際人類基因組計(jì)劃啟動，到2003年，絕大多數(shù)人類基因組已獲得測定。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，人類的基因并非一條完整的信息鏈，而是被許多不能編碼遺傳信息的序列切割得支離破碎。這些不能編碼遺傳信息的DNA在當(dāng)時(shí)被稱為“垃圾”。大自然為什么要在人類基因里放置那么多的垃圾？二十年來，隨著科學(xué)家的努力，真相逐漸浮出水面：這些垃圾DNA自有作用，而其中非常重要的一類就叫做“內(nèi)含子”。

(相關(guān)資料圖)

撰文 | 玉寶（中科院遺傳發(fā)育所博士）

內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)

龍生龍，鳳生鳳，遺傳是我們生活中隨處可見的現(xiàn)象?？茖W(xué)家很早就猜測，一定是有什么物質(zhì)能把上一代的性狀傳遞給下一代。十九世紀(jì)中葉，奧地利科學(xué)家孟德爾（Gregor Johann Mendel）根據(jù)他多年的植物雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果假想出“遺傳因子”這樣一個(gè)獨(dú)立的遺傳單位，并認(rèn)為生物的所有性狀都是通過遺傳因子來傳遞的。1903年，美國生物學(xué)家沃爾特·薩頓（Walter Sutton）和德國生物學(xué)家鮑維里（Theodor Heinrich Boveri）提出遺傳因子位于染色體上，染色體是遺傳物質(zhì)的載體。1909年，丹麥遺傳學(xué)家約翰遜（Wilhelm Johannsen）提出了“Gene”（基因）的概念，以此來替代孟德爾假定的“遺傳因子”。從此，“基因”一詞一直在遺傳學(xué)中沿用至今。

約翰遜認(rèn)為，“基因”背后應(yīng)該有一個(gè)化學(xué)實(shí)體。人們相信只要弄清了基因的結(jié)構(gòu)，基因如何編碼遺傳信息、遺傳信息如何傳代就很容易解釋了。在二十世紀(jì)五十年代以前，基因的結(jié)構(gòu)并不清晰，直到1953年美國分子生物學(xué)家沃森（James Watson）和英國生物學(xué)家克里克（Francis Crick）發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這個(gè)問題才得以解決。但科學(xué)家對基因的編碼方式提出了多種理論，例如“一個(gè)基因一個(gè)酶（蛋白）”就是流行于四十年代的理論。后來人們發(fā)現(xiàn)，這個(gè)理論遇到的例外越來越多：不少基因發(fā)揮功能的實(shí)體是RNA，或者數(shù)個(gè)基因編碼一個(gè)蛋白，或者一個(gè)基因編碼數(shù)個(gè)蛋白。因此，“基因”的定義變得越來越復(fù)雜。

1977年，美國科學(xué)家夏普（Philip Sharp）與英國科學(xué)家理查德·羅伯茨（Richard Roberts） 在研究腺病毒遺傳時(shí)，各自用電鏡技術(shù)獨(dú)立發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子[1, 2]，并提出了“斷裂基因理論”，兩人因此榮獲1993年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。電鏡技術(shù)對于內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)功不可沒，它的分辨率能夠看到納米尺度的DNA或RNA分子。不過，內(nèi)含子的命名另有其人。在1978年的一篇短文中，美國科學(xué)家沃特·吉爾伯特（Walter Gilbert）提議用“intron（內(nèi)含子）”指代mRNA前體中的非編碼序列。mRNA是基因由DNA序列“翻譯”成蛋白質(zhì)序列的模板。

1980年，吉爾伯特與弗雷德里克·桑格（Frederick Sanger）、保羅·伯格（Paul Berg）因發(fā)明基因測序技術(shù)而共同獲得諾貝爾化學(xué)獎。

斷裂基因理論認(rèn)為，真核生物的基因組中，基因的序列是不連續(xù)的，在基因的編碼區(qū)域之間含有大量的不編碼序列，從而打斷了對應(yīng)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。內(nèi)含子，一般指的是真核生物基因中不編碼蛋白質(zhì)，是在mRNA加工過程中被剪切掉的DNA序列。這個(gè)剪切反應(yīng)由“剪接體（spliceosome）”完成；剪接體的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，由100多個(gè)“零件”組成。

圖1 轉(zhuǎn)錄過程中內(nèi)含子被剪切的示意圖。在真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄過程中，“剪接體”行使功能將內(nèi)含子去除，將外顯子（綠色）組合到一起，形成成熟的mRNA。圖源：李宏彬等

內(nèi)含子的功能

真核細(xì)胞蛋白質(zhì)編碼基因與原核細(xì)胞的最大區(qū)別，就在于前者中存在內(nèi)含子而后者沒有。通常，內(nèi)含子的長度遠(yuǎn)比編碼蛋白的外顯子序列長。內(nèi)含子的存在，使得真核細(xì)胞在傳代和基因表達(dá)時(shí)消耗了大量的物質(zhì)和能量，這無疑會增加機(jī)體的生存負(fù)擔(dān)。那么，這么長的非編碼片段嵌在基因里，到底有什么用呢？

內(nèi)含子發(fā)現(xiàn)之后的20年里，人們對它的起源和功能方面的研究較少。實(shí)際上，直到21世紀(jì)初，人類基因組草圖剛完成那幾年，還有一個(gè)流行的說法：“人類基因組中95%的序列都是垃圾DNA”。相信有讀者記得當(dāng)時(shí)的這個(gè)說法。當(dāng)然，那時(shí)候人們所說的垃圾序列中，就包括了內(nèi)含子。在科研人員的不斷努力下，“垃圾DNA”的說法逐漸被推翻，內(nèi)含子的重要功能也逐步清晰起來。

一系列研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子有助于維持基因的穩(wěn)定，還會參與基因的表達(dá)和調(diào)控。具體來說，基因中的內(nèi)含子與外顯子通過可變剪接產(chǎn)生不同的外顯子組合，進(jìn)而翻譯出多種蛋白質(zhì)，提高了蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性；內(nèi)含子中的增強(qiáng)子（序列）等調(diào)控元件可以調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄效率；內(nèi)含子中的一些RNA元件還可以避免轉(zhuǎn)錄提前終止。

早期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子可以維持基因轉(zhuǎn)錄時(shí)DNA序列的穩(wěn)定：防止基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)形成“R環(huán)”（R-loop）。所謂R環(huán)，顧名思義就是“R”形的結(jié)構(gòu)，它是指由轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈與打開的雙鏈DNA的其中一條發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，形成RNA-DNA雜合鏈的結(jié)構(gòu)，同時(shí)，未配對的另一條DNA鏈處于游離狀態(tài)（見圖2）。而內(nèi)含子的存在可以減少R環(huán)形成，保持基因組DNA的穩(wěn)定性。不過，R環(huán)也并不都是“壞的”，后來人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中的R環(huán)也是有生物功能的——它可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如轉(zhuǎn)錄起始和延伸、表觀遺傳調(diào)控等。另外，R環(huán)的失調(diào)與DNA損傷、基因組不穩(wěn)定、基因高頻重組也有關(guān)。

圖2. 基因轉(zhuǎn)錄時(shí)形成“R環(huán)”（R-loop）的兩種方式。圖源：張譯勻等

內(nèi)含子還有許多其他的功能。幾年前，加拿大舍布魯克大學(xué)的Elela團(tuán)隊(duì)和美國麻省理工學(xué)院的Bartel團(tuán)隊(duì)同時(shí)發(fā)表了兩篇論文**[4, 5]**，表明內(nèi)含子可以協(xié)助機(jī)體應(yīng)對營養(yǎng)缺乏的壓力，使其“扛餓”。

Elela團(tuán)隊(duì)逐個(gè)敲除了釀酒酵母的200多個(gè)內(nèi)含子，看看是否會影響酵母的生存能力。通過測序以及相應(yīng)的表型分析，研究人員發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子具有調(diào)控酵母適應(yīng)營養(yǎng)匱乏（饑餓）的功能。Bartel團(tuán)隊(duì)則發(fā)現(xiàn)酵母中有34個(gè)內(nèi)含子一直存在于細(xì)胞中，以剪切后的全長或線性形式存在，它們受到經(jīng)典的TOR代謝通路的調(diào)控，在營養(yǎng)匱乏時(shí)能夠減緩酵母的生長速度，提高了酵母的適應(yīng)性和生存率。這些內(nèi)含子發(fā)揮應(yīng)對逆境的功能，與其所在基因的功能無關(guān)。內(nèi)含子關(guān)乎機(jī)體的生死存亡，那么在它生物演化過程中得以保留也就可以理解了。

內(nèi)含子可以分為四類：Ⅰ型內(nèi)含子、Ⅱ型內(nèi)含子、剪接體內(nèi)含子、tRNA內(nèi)含子。其中，一般意義上的內(nèi)含子就是剪接體內(nèi)含子，顧名思義就是自帶剪接體的內(nèi)含子，其”剪接體”的蛋白立體結(jié)構(gòu)已被解析出來。生成mRNA的剪接反應(yīng)非常精準(zhǔn)，錯(cuò)誤率極低——要知道，若移碼錯(cuò)位一個(gè)堿基，就會導(dǎo)致后續(xù)轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生異常，無法生成蛋白質(zhì)或生成錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)。

Ⅰ型內(nèi)含子存在于細(xì)菌、噬菌體、原生生物、真菌中，能夠自我剪接。Ⅱ型內(nèi)含子存在于細(xì)菌和細(xì)胞器基因組中，同樣能夠自我剪接，但是機(jī)制與1型內(nèi)含子不同，與剪接體內(nèi)含子的剪接機(jī)制類似。tRNA內(nèi)含子存在于真核細(xì)胞和古菌中，剪接過程需要內(nèi)切酶和ATP。

內(nèi)含子的產(chǎn)生機(jī)制

真核細(xì)胞里到底是怎么出現(xiàn)內(nèi)含子的？

關(guān)于內(nèi)含子的產(chǎn)生機(jī)制，目前比較流行的解釋是“introner理論”[6]，它可以解釋剪接體內(nèi)含子的起源。introners可以看做是基因組中的“寄生蟲”，在基因組中通過“復(fù)制”“粘貼”的方式“制造”了大量內(nèi)含子。2009年，科學(xué)家在微單胞藻中發(fā)現(xiàn)了introner，隨后在鞭毛藻、某些真菌、尾索動物中也發(fā)現(xiàn)了它的蹤跡。

科學(xué)家的多項(xiàng)研究表明，這個(gè)“復(fù)制”“粘貼”的過程可以在整個(gè)基因組中大規(guī)模地重復(fù)：在整個(gè)生物演化過程中，introner在不同的真核生物中不停制造著內(nèi)含子。比如，在過去的十萬年中，真菌基因組中的多數(shù)內(nèi)含子都是Introner引入的**[7]**。

圖3. Introner如何“制造”內(nèi)含子? Introner把內(nèi)含子序列插入基因組中，從而“割裂”原有的DNA序列，生成新的外顯子。圖源：Merrill Sherman

研究發(fā)現(xiàn)，在一些物種中，introner產(chǎn)生的序列與DNA轉(zhuǎn)座子有很強(qiáng)的相似性，例如Polarella glacialis和Micromonas這兩種藻類就是這樣。DNA轉(zhuǎn)座子代表了一個(gè)更大的遺傳元件家族，又稱轉(zhuǎn)座元件或“跳躍基因”；轉(zhuǎn)座子可以將自身序列大量拷貝并插入基因組中。introner和轉(zhuǎn)座子的這種的相似性，提示了一部分內(nèi)含子可能來源于轉(zhuǎn)座子。Introner機(jī)制產(chǎn)生的內(nèi)含子往往在短期內(nèi)大量出現(xiàn)在基因組中，帶有很強(qiáng)的隨機(jī)性，這可以解釋為什么內(nèi)含子在真核生物基因組中的分布并不均勻。

不過，目前introner只發(fā)現(xiàn)于部分物種。例如，內(nèi)含子的涌現(xiàn)似乎在水生生物中更常見：內(nèi)含子出現(xiàn)在水生生物基因組中的可能性是陸生生物基因組的6倍多。此外，近3/4的含有內(nèi)含子的水生物種，其基因組擁有多個(gè)序列相似的內(nèi)含子。這種序列相似的現(xiàn)象其實(shí)就是基因水平轉(zhuǎn)移，即基因序列從一個(gè)物種轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物種。這種形式的基因轉(zhuǎn)移，往往發(fā)生在水生環(huán)境或物種共生的情況下，例如宿主和寄生蟲之間。

水生環(huán)境有助于水平基因轉(zhuǎn)移，是因?yàn)樵谒越橘|(zhì)中各種遺傳物質(zhì)可以自由流動。單細(xì)胞生物在水中很容易吸收或融合外源DNA；更復(fù)雜的多細(xì)胞生物在水中產(chǎn)卵或受精，也有機(jī)會接觸到外源DNA或RNA。有研究發(fā)現(xiàn)，在將近300多個(gè)硬骨魚類基因組中曾發(fā)生了近1000個(gè)基因水平轉(zhuǎn)移或內(nèi)含子插入事件**[8]**。相比之下，陸地生物之間發(fā)生基因水平轉(zhuǎn)移的頻率要低得多。

內(nèi)含子對生物演化的意義

同樣是真核生物，哺乳動物的內(nèi)含子比酵母的更多更長。例如，人類內(nèi)含子序列長度約占基因組的25%，每個(gè)基因平均約有9個(gè)內(nèi)含子，這樣有助于基因?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜多樣的功能。人類mRNA前體中內(nèi)含子的長度差異非常大，可以從50個(gè)堿基到百萬個(gè)堿基不等。

內(nèi)含子在物種間及物種內(nèi)部的分布也不均衡。同一物種不同個(gè)體的同一基因中，有的有內(nèi)含子，有的沒有；不同物種同一基因的內(nèi)含子的長度、數(shù)目和所處位置等都不相同。如Sccoxl.2b和Ancoxl.3這兩個(gè)同源基因的內(nèi)含子，其序列有70%相同，但內(nèi)含子旁邊的外顯子排列順序差異很大，這可能是內(nèi)含子在不同物種中發(fā)生了轉(zhuǎn)移的結(jié)果。

內(nèi)含子的存在需要有相應(yīng)的機(jī)制保證。真核生物因?yàn)榧?xì)胞中有核膜，為基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程在空間上的分離提供了基礎(chǔ)，同時(shí)細(xì)胞中的大量線粒體可以提供能量，所以內(nèi)含子的存在有其物質(zhì)基礎(chǔ)。而原核生物，沒有核膜結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步的，所以原核生物無需內(nèi)含子來保持DNA序列的穩(wěn)定性。

科學(xué)家認(rèn)為，內(nèi)含子有助于推動基因家族或物種的演化?；蚪M通過組合外顯子和內(nèi)含子，通過可變剪接的機(jī)制制造新的變異，生成新的調(diào)控模式或功能模塊（酶、蛋白質(zhì)、通路等）。例如，可以產(chǎn)生毒素的物種通常需要在基因?qū)用婵焖俳M合，進(jìn)而生成新的毒液（復(fù)雜的肽類混合物），以適應(yīng)不同的獵物或應(yīng)對天敵。動物的免疫系統(tǒng)則需要快速重排MHC基因，不斷產(chǎn)生新的抗體或抗原呈遞細(xì)胞，以應(yīng)對生活環(huán)境中多變的抗原。這種快速進(jìn)化機(jī)制在自然界中很普遍，內(nèi)含子往往會參與到這些機(jī)制當(dāng)中。

參考文獻(xiàn)

[1] Berget SM et al. Spliced segments at the 5" terminus of adenovirus 2 late mRNA. PNAS. 1977, 74 (8): 3171–3175.

[2] Chow LT, et al. "An amazing sequence arrangement at the 5" ends of adenovirus 2 messenger RNA". Cell. 1977, 12 (1): 1–8.

[3] Gilbert W. Why genes in pieces. Nature. 1978, 271 (5645): 501.

[4] Elela AS et al. Introns are mediators of cell response to starvation. Nature. 2019, 565(7741): 612-617.

[5] Bartel DP. Excised linear introns regulate growth in yeast. Nature 2019, 565(7741): 606-611

[6] A.Z. Worden, et al. Green evolution and dynamic adaptations revealed by genomes of the marine picoeukaryotes Micromonas. Science, 2009, 324 (5924), 268-272

[7] Ate van der Burgt et al. Birth of New Spliceosomal Introns in Fungi by Multiplication of Introner-like Elements. Current Biology, 2012: 22(13), 1260-1265

[8] Zhang HH et al.Horizontal transfer and evolution of transposable elements in vertebrates. Nat Commun. 2020, 11(1):1362.

本文受科普中國·星空計(jì)劃項(xiàng)目扶持

出品：中國科協(xié)科普部

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